Influence of melatonin associated with the Bio-Gide® membrane on osteoblast activity: an in vitro Study / Influência da melatonina associada à membrana bio gide® na atividade de osteoblastos: um estudo in vitro

ABSTRACT Melatonin (MLT) is a hormone responsible for regulating several physiological processes. It has been shown that MLT can be an important mediator in bone formation and stimulation, promoting osteoblast differentiation. In clinical practice, in tissue regeneration procedures, it is necessary to use membranes or barriers, associated with biomaterials, or not. The aim of this in vitro study was to assess the effect of melatonin on the activity of osteoblastic cells, associated, or not, with a resorbable collagen membrane (Bio-Gideä). For this, mice-derived pre-osteoblastic cells MC3T3 obtained from the ATCC (American Type Culture Collection) were used. Cultured cells were subject to the following treatments: MLT with a concentration of 1mM, a Bio-Gideä membrane and a membrane associated with MLT (Bio-Gideä + MLT). Proliferation and cell viability assays and protein lysate (ELISA test) quantification for the BMP-2 protein were carried out, in periods of 72 hours, 7 days and 10 days. After analyzing the data (one-way ANOVA, alpha=5%) it was observed that when MLT was used in isolation, there was an increase in cell proliferation and viability in osteoblastic cells (p<0.05). But, when MLT was associated with resorbable membranes, there was an inverse behavior, both in terms of proliferation and viability (p<0.05). In the case of the ELISA test, no secretion of BMP-2 was detected in any of the analyzed groups. It is concluded that MLT has a stimulatory effect on osteoblasts, but, when associated with Bio-Gideä resorbable membranes, it does not show any viable action in osteoblastic cell stimulation.

RESUMO A melatonina (MLT) é um hormônio responsável pela regulação de diversos processos fisiológicos no nosso organismo. Tem sido demonstrado que a melatonina possa ser um importante mediador na formação e estimulação óssea, promovendo a diferenciação dos osteoblastos. Clinicamente, para o procedimento de regeneração tecidual, faz-se necessário a utilização de membranas ou barreiras, associadas ou não a biomateriais. Assim, o objetivo deste estudo in vitro foi avaliar o efeito da melatonina na atividade de células osteoblásticas, associada ou não a uma membrana de colágeno reabsorvível (Bio-Gide®). Para isto foram utilizadas células pré-osteoblásticas MC3T3 do ATCC (American Type Culture Collection), de camundongos. As células em cultura foram submetidas aos seguintes tratamentos: MLT na concentração de 1mM, membrana Bio Gide® e membrana associada à MLT (Bio-Gide® + MLT). Foram realizados os ensaios de proliferação e viabilidade celular e quantificação do lisado proteico (teste ELISA), para a proteína BMP-2, nos períodos de 72 horas, 7 e 10 dias. Após a análise dos dados (ANOVA um critério, alfa=5%) pode-se observar que a MLT quando utilizada sozinha, resultou em um aumento na proliferação e viabilidade celular nas células osteoblásticas (p<0,05). Entretanto, quando a MLT foi associada à membrana reabsorvível foi observado um comportamento inverso, tanto na proliferação quanto na viabilidade (p<0,05). Para o teste ELISA realizado, não houve secreção detectável de BMP-2 para nenhum grupo analisado. Conclui-se que a melatonina possui uma ação estimuladora nos osteoblastos, mas quando associada à membrana reabsorvível Bio-Gide®, não demonstra uma ação viável na estimulação de células osteoblásticas.

Melatonin has a stimulatory effect on osteoblasts by upregulating COL-I and OPN expression/secretion / Melatonina tem efeito estimulador em osteoblastos, pela regulação positiva da expressão/secreção de COL-I e OPN

ABSTRACT Melatonin (MLT) is a potential signaling molecule in the homeostasis of bone metabolism and may be an important mediator of bone formation and stimulation. The aim of this in vitro study was to evaluate the effect of MLT on the viability, mRNA/protein expression and mineralization of pre-osteoblastic cells. The concentrations 5, 2.5, 1, 0.1 and 0.01 mM MLT were tested on pre-osteoblastic cells (MC3T3) compared to control (no MLT), evaluating proliferation and cell viability (C50), gene expression (RT-PCR) and secretion (ELISA) of COL-I and OPN at 24h, 48h and 72h, and the formation of mineral nodules (alizarin red and fast red) after 10 days of treatment. MLT at 5 and 2.5 mM proved to be cytotoxic (C50), so only 0.01, 0.1 and 1 mM were used for the subsequent analyses. OPN mRNA expression increased with MLT at 0.1 mM - 1 mM, which was followed by increased secretion of OPN both at 24h and 72h compared to the remaining groups (p <0.05). COL-I mRNA and COL-1 secretion followed the same pattern as OPN at 0.1 mM MLT at 72h of treatment (p <0.05). Regarding mineralization, all MLT doses (except 1mM) caused an increase (p <0.05) in the formation of mineral nodules compared to the control. Melatonin at 0.01mM - 1mM had a stimulatory effect on osteoblasts by upregulating COL-I and OPN expression/ secretion and mineralization, thereby fostering osteogenesis.

RESUMO A melatonina (MLT) é uma molécula potencial de sinalização na homeostase do metabolismo ósseo e pode ser um importante mediador da formação e estimulação óssea. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar o efeito da MLT na viabilidade, na expressão do mRNA da proteína e mineralização de células préosteoblásticas. As concentrações de MLT 5, 2,5, 1, 0,1 e 0,01 mM foram testadas em células pré-osteoblásticas da linhagem MC3T3 em comparação ao controle (sem MLT), avaliando a proliferação e a viabilidade celular (C50), expressão gênica (rtPCR) e secreção (Elisa) de Colágeno tipo 1 (COL-I) e osteopontina (OPN) às 24, 48 e 72 horas, além da formação de nódulos minerais por meio do teste vermelho de Alizarina fast red após 10 dias de tratamento. MLT a 5 e 2,5 mM provou ser tóxico (C50). Portanto, as concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM foram utilizadas para as análises subsequentes. A expressão do mRNA da OPN aumentou com MLT a 0,1 mM-1mM, seguida pela secreção aumentada de OPN às 24 e 72 horas em comparação aos demais grupos (p<0,05). O mRNA de COL-I e a secreção de COL-I seguiram o mesmo padrão do OPN a 0,1 mM de MLT em 72 horas de tratamento (p<0,05). Em relação à mineralização, todas as doses de MLT (exceto 1mM) causaram aumento (p<0,05) na formação de nódulos minerais em comparação ao controle. A MLT na concentração entre 0,01mM a 1 mM teve um efeito estimulador sobre os osteoblastos, ao regular positivamente a expressão e secreção de COL-I e OPN, além da mineralização, favorecendo a osteogênese.

Avaliação da eficácia das escovas convencionais e multifilamentadas: Um estudo randomizado cego controlado / Effectiveness of conventional and multifi lamentary toothbrushes: a randomized, blinded, controlled trial

Objetivo: comparar o efeito de escovas multifilamentadas com as escovas dentais convencionais, na formação do biofilme dental bacteriano na área dentogengival, em indivíduos saudáveis. Material e métodos: para a realização deste estudo de delineamento prospectivo, cruzado, cego e randomizado, foram selecionados 16 voluntários periodontalmente saudáveis, os quais inicialmente foram submetidos a uma adequação bucal. Após sete dias de adequação, os indivíduos foram aleatoriamente divididos em quatro grupos: A) escova multifilamentos nacional (Sanifill Infinite); B) escova multifilamentos importada (Curaprox); C) escova convencional 1 (Bitufo Class macia); e D) escova convencional 2 (Oral B Indicator ), utilizando o mesmo dentifrício para os quatro grupos. Os voluntários foram instruídos a usarem somente o método de higiene referente ao grupo a que foram designados, por um período de 14 dias, com intervalos (washout) de sete dias entre os períodos experimentais. Durante o washout, todos os indivíduos fizeram uso de escovas, dentifrícios e fio dental padronizados. Os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados nos tempos 0 e 14 dias: índice de placa visível e corada (IPV e IPC) e índice de sangramento gengival (ISG). Resultados: após análise dos dados, não foram observadas diferenças estatísticas (p > 0,05), nem intragrupo e nem intergrupo, para todos os parâmetros analisados. Conclusão: escovas convencionais e multifilamentadas foram igualmente eficazes no controle do biofilme dental bacteriano, na área dentogengival.

Objective: to compare the effect of multifilament toothbrushes and the conventional ones relating it to the formation of dental bacterial biofilm in the dentogingival region in healthy individuals. Material and methods: to conduct this study in a prospective, crossed, blind and randomized outlining way, sixteen periodontal healthy volunteers were selected and initially submitted to an oral adjustment. After seven days of adjustment, the individuals were randomly divided into four groups: A) the national multifilament toothbrush (Sanifi ll Infi nite); B) the imported multifilament toothbrush (Curaprox); C) the conventional toothbrush 1 (Bitufo Class Macia); and D) the conventional toothbrush 2 (Oral B Indicator); the same toothpaste was utilized by the four groups. The volunteers were instructed to the usage of only one method of oral hygiene which is related to the group they were designed for a period of fourteen days, with intervals (washout) of seven days between the experimental periods. During the washout, all the individuals made use of the toothbrushes, toothpastes and standardized dental floss. The following clinical parameters were evaluated at 0 day and 14 days: visible plaque index and disclosed plaque index (VPI and DPI) and gingival bleeding index (GBI). Results: no statistically significant differences were observed (p > 0,05), neither with the intragroup nor the intergroup in all the parameters analyzed. Conclusion: conventional toothbrushes and the multifilamented ones were equally effective in controling dental bacterial biofilm in the dentogingival region.

Microbiological Seal of Two Types of Tapered Implant Connections

Abstract Tapered implant connections have gained wide popularity for being more resistant to fatigue and for promoting a better seal against bacterial infiltration than conventional connections. The aim of this study was to evaluate the bacterial seal at the implant-abutment interface using two Morse taper implant models, by in vitro microbiological analysis. Eleven non-indexed and 11 indexed abutments were selected and connected to their respective implants with a 20 N torque, according to manufacturer's recommendation. Microbiological analysis was carried out using colonies of Escherichia coli transported directly from a culture dish to the prosthetic component. For control, one non-contaminated abutment-implant set from each group (negative control) and one contaminated implant with no abutment (positive control) were used. The specimens were immersed in BHI broth and maintained in an incubator at 37 °C for 14 days to assess the development of bacterial contamination. The results revealed that 36.4% (n=4) of the indexed components and 90.9% (n=10) of the non-indexed components allowed bacterial leakage, with significant difference between groups (p=0.0237). In conclusion, both tapered components failed to provide adequate sealing to bacterial leakage, although the indexed type components showed a superior seal compared with non-indexed components.

Resumo Conexões de implantes cônicos cresceram em popularidade por serem mais resistentes à fadiga e por promover uma melhor vedação contra infiltração bacteriana do que as conexões convencionais. O objetivo deste estudo foi avaliar o selamento bacteriano na interface implante-pilar utilizando dois modelos de implantes cone Morse, por meio de análise microbiológica in vitro. Onze pilares não indexados e 11 pilares indexados foram selecionados e conectados aos seus respectivos implantes com um torque de 20 N, de acordo com a recomendação do fabricante. A análise microbiológica foi realizada utilizando colônias de Escherichia coli retirados diretamente a partir de uma placa de cultura para o componente protético. Para os grupos de controle, foi utilizado um pilar-implante não contaminado de cada grupo (controle negativo) e um implante contaminado sem pilar (controle positivo). Os espécimes foram imersos em caldo BHI e mantidos numa incubadora a 37 °C durante 14 dias, para monitorar o desenvolvimento de contaminação bacteriana. Os resultados revelaram que 36,4% (n=4) dos componentes indexados e 90,9% (n=10) dos componentes não indexados obtiveram infiltração bacteriana, com diferença significativa entre os grupos (p=0,0237). Como conclusão, os dois componentes cônicos não conseguiram proporcionar uma vedação adequada contra infiltração bacteriana, embora os componentes do tipo indexados mostrassem uma vedação superior, quando comparados com componentes não indexados.

Evaluation of the Biological Behavior of Mucograft® in Human Gingival Fibroblasts: An In Vitro Study

Mucograft(r) is a resorbing porcine matrix composed of type I and type III collagen, used for soft tissue augmentation in guided tissue bony regeneration procedures. This in vitro study aimed to evaluate the biological behavior of Mucograft(r) in human gingival fibroblasts, as well as the ability of the matrix to induce production of extracellular matrix. Six resorbing Mucograft(r) matrices (MCG) were cut into 3 x 2 mm rectangles and 5 x 5 mm squares and were placed in 96- and 24-well plates, respectively. The control group (CTRL) consisted of cells plated on polystyrene without the MCG. After one, two, three and seven days, cell proliferation and viability were assessed using the Trypan exclusion method and MTT test, respectively. Type III collagen (COL 3A1) and vimentin (VIM) expression were also evaluated at 10 and 14 days, using Western blotting. Statistical analysis, using ANOVA with post hoc Bonferroni test, revealed that human gingival fibroblasts from MCG showed similar results (p>0.05) for proliferation and viability as the cells cultured on CTRL. After 14 days, a significant decrease in COL 3A1 expression (p<0.05) was observed when cultured with the MCG. VIM expression showed no significant difference at any time period (p>0.05). Although no increase in extracellular matrix secretion was observed in this in vitro study, Mucograft(r) presented cellular compatibility, being an option for a scaffold whenever it is required.

Resumo A Mucograft(r) é uma matriz reabsorvível, de origem suína, composta de colágenos do tipo I e III, utilizada para aumento de tecido mole em regeneração óssea guiada. Este estudo in vitro teve como objetivo avaliar o comportamento biológico da Mucograft(r), em fibroblastos gengivais humanos, bem como a indução da síntese de matriz extracelular. Seis matrizes reabsorvíveis de Mucograft(r) (MCG) foram cortadas em retângulos e quadrados medindo 3 x 2 mm e 5 x 5 mm e alocadas em placas de 96 e 24 poços, respectivamente. O grupo controle (CTRL) consistiu no plaqueamento celular em poliestireno, sem MCG. Após um, dois, três e sete dias, a proliferação e a viabilidade celular foram avaliadas utilizando o corante vital azul de Trypan e o teste MTT, respectivamente. Além disso, a expressão de colágeno tipo III (COL 3A1) e vimentina (VIM) foi avaliada após 10 e 14 dias, por meio de Western-blotting. Após análise estatística (Anova e pós teste de Bonferroni), pode-se observar que os fibroblastos gengivais humanos, cultivados sobre MCG, apresentaram proliferação e viabilidade semelhantes em comparação às células que foram cultivadas apenas no poliestireno (CTRL). Após 14 dias, notou-se uma diminuição significativa da expressão de COL 3A1 (p<0,05) quando as células foram cultivadas sobre a MCG. A expressão da VIM não mostrou diferença significativa em nenhum dos períodos estudados (p>0,05). No presente estudo in vitro pode-se concluir que apesar de não ter sido observado aumento da síntese de matriz extracelular, a Mucograft(r) apresentou compatibilidade celular, sendo uma opção de biomaterial em casos que o arcabouço é necessário.